Tout d'abord, EcoR1 et Xba1 laissent des surplombs en 5' lorsqu'ils digèrent l'ADN (tout comme Nde1). Dans les deux cas l'extrémité 3' est évidée c'est pourquoi la polyermase peut ajouter des bases. Deuxièmement, toutes les polymérases ne peuvent ajouter des bases qu'à une extrémité 3', donc le Klenow ajoutera 4 bases à l'extrémité 3' reculée des deux sites pour générer des extrémités franches.
Les enzymes de restriction laissent-elles un 5 phosphate ?
Les vecteurs et les inserts digérés par les enzymes de restriction contiennent les modifications terminales nécessaires (5' phosphate et 3' hydroxyle), contrairement aux fragments créés par la réaction en chaîne de la polymérase (PCR).
Peut-on ligaturer les bouts francs ?
Ligature des extrémités franches
La ligature des extrémités franches n'implique pas l'appariement des bases des extrémités saillantes, donc toute extrémité franche peut être ligaturée à une autre extrémité franche. Des extrémités franches peuvent être générées par des enzymes de restriction telles que SmaI et EcoRV.
La polymérase Taq produit-elle des extrémités franches ?
Oui… Taq Polymerase ajoute A-Overhangs si vous maintenez l'étape d'extension finale à 72 dC sur PCR. Principalement utilisé pour le clonage TA.
Pourquoi utiliser le fragment de Klenow dans le séquençage de l'ADN ?
Le fragment de Klenow est extrêmement utile pour les tâches de recherche telles que: Synthèse d'ADN double brin à partir de modèles simple brin . Remplir les extrémités 3' reculées des fragments d'ADN pour rendre le surplomb 5'émoussé . Digérer les surplombs saillants de 3 pi.
